LentiCRISPR v2 诳骗指南丝袜 porn
网址：https://www.addgene.org/52961/
1、克隆 gRNA 使用 BsmBI 位点，载体不错切出一个~1.9 kb 的 filler 片断，便于 confirm 酶切生效并利于载体回收；
2、BsmBI 的位点是 
，酶切之后不需要 CIP 脱磷也不会自连！
3、Cas9 的 C 端带有 FLAG tag,不错 WB 好像 Immunostaining
4、EF1-a promoter 被优化的小而强，极大提升了慢病毒包装的后果
5、载体带有 Puromycin 抗性，不错富集转染/感染生效的细胞。
如何打算 gRNA
1、gRNA 打算设施和原则请参考上第一步“lentiCRISPR v2 诳骗指南”，畅通如下： https://www.addgene.org/52961/
2、关于 lentiCRISPR v2 克隆，其合成的 oligo 结尾和 pX330 不同，请提神打算；
举个例子讲解（克隆小白千万提神 oligo 的办法）
如何克隆载体
1、Backbone 的酶切体系同上方才略“ 如何打算 gRNA“（讲解：不脱磷处置参考黑框，脱磷参考红框内操作）
李月 反差2、Oligo 的退火条款也参考上方才略（讲解：若是载体不脱磷，oligo 不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo 就需要加磷处置！！！（红色框内是 FengZhang 提供的 protocol，打算脱磷，仅当作参考）
仅作参考
病毒包装体系
1、包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish丝袜 porn，6x106 293T）
2、转染条款：用汉恒生物的细胞转染试剂 LipoFiterTM
3、荟萃 48hr 和 72hr 病毒上清，待用。
病毒包装的 protocol 相配多，小编只列了基本的信息。后续会出详备写慢病毒包装才略的干货！
目的细胞系的感染/转染
1、转染 （2 μg plasmid/60 mm dish，细胞密度 60-80%） 【v2=lentiCRISPR v2，下同】
2、感染 （1-5 ml 病毒上清）【v2=lentiCRISPR v2，下同】
PCR 测序产生的套峰泄漏图
KO 单克隆的获得
1、单克隆的挑取---单克隆不错有限稀释到 96-well plate（～30 cells/plate）（293T、HeLa、MEF 等细胞系保举使用）。若是剪辑后果 50%，保举分两块 plate 即可，最终拿到 20-30 个单克隆一般不错得到生效 KO 的细胞系；好像铺到 100 mm dish 里，一周后挑取单克隆（这种设施得当单细胞进击易成活的细胞系如，然而挑取的单克隆偶尔不纯，或然需要重新亚克隆）。
2、单克隆的已然---左证打算，保举使用酶堵截然的设施（见打算部分），通量高；若是抗体相比好用，保举使用 WB 检测卵白，这种设施最透澈；最末一种设施便是径直测序已然，该种设施费时吃力花钱，冷落打算时尽量逃匿。
3、有限稀释法（悬浮细胞适用此法）---50-100 cells 均匀分到 96-well plate
4、单克隆挑取法
KO 单克隆的已然
1、径直测序好像酶堵截然
抽取 genomic DNA，然后 PCR 测序好像好像酶堵截然
2、WB 已然
若是抗体好用，径直用 dot blot 好像免疫荧光染色不错，速率快，通量高。虽然庸碌WB也不错。
汉恒生物领有丰富敲除细胞系构建训戒，不错结束透澈敲除目的基因的办法咱们的上风：
·种子优良--严选低代数细胞开端，无支原体无黑胶虫汉恒生物系数的细胞均从中科院细胞库购买，代数低无浑浊，还不错提供 STR 检测禀报。
·简便高效--慢病毒系统，提升感染后果，镌汰履行周期汉恒生物选拔慢病毒系统转染目的细胞，提升感染后果，更高效快速的挑选 KO 细胞。
·性状强壮--严酷的筛选及靶基因敲除考证体系汉恒生物系数的敲除单克隆皆通过构建T载体进行测序考证，了了看出 DNA 序列的具体变化，确保敲除性状强壮不规复。
·活力无损--严格的质控办法丝袜 porn，建系后连气儿 3 代细胞增殖活力评估
